Kultivační důkaz mikroorganismů v okolním prostředí

Příspěvek byl převzat z časopisu Biologie-chemie-zeměpis, časopisu pro výuku přírodovědných předmětů na základních a středních školách, vydávaného SPN - pedagogické nakladatelství, a.s.

Mikroorganismy demonstrujeme v hodinách přírodopisu a biologie většinou tak, že je pozorujeme mikroskopem. Další možností je nechat žáky, aby si sami vypěstovali mikroorganismy na pevných agarových půdách. Tímto způsobem se dají pěstovat bakterie, kvasinky i plísně.

Cíl

Namnožit mikroorganismy do takového množství, aby byly viditelné pouhým okem, a tím dokázat jejich přítomnost v okolním prostředí. Dalším cílem může být namnožení mikroorganismů k jiným praktickým cvičením.

Materiál a pomůcky:

• Petriho misky se sterilní agarovou půdou
• mikrobiologická klička (popřípadě sterilní plastová jednorázová klička nebo sterilní vatový tampón)
• permanentní fix

Hotové sterilní agarové půdy v plastových Petriho miskách lze použít např. od firmy Dioxo (viz internetové stránky www.oxoid.cz). Půda s univerzálním použitím umožňující růst širokého spektra mikroorganismů je např. Nutrient Agar (připravená půda v plastových Petriho miskách má firemní kód PO5025A) nebo Tryptone Soya Agar (připravená půda v plastových Petriho miskách má firemní kód PO5012A). Pro pěstování kvasinek a plísní je vhodný např. Sabouraud Dextrose Agar (připravená půda v plastových Petriho miskách má firemní kód PO5001A). Tyto Petriho misky jsou určeny pro jedno použití a pracujeme s nimi bez jakékoliv předchozí úpravy. U stejné firmy lze zakoupit i živné půdy v prášku pro vlastní přípravu agarových půd. Plastové Petriho misky a další laboratorní materiál dodává např. firma P-lab (viz internetové stránky www.p-lab.cz).

Postup práce

Agarovou půdu v Petriho miskách kontaminujeme nejrůznějším způsobem - každý žák si vybere jednu z možností. Alespoň jednu Petriho misku necháme bez kontaminace jako negativní kontrolu (stačí jedna pro celou třídu). Každý žák si označí svou Petriho misku na spodní straně permanentním fixem.

Možnosti kontaminace - příklady:

• na agarovou půdu nasypeme několik zrníček zahradní zeminy
• Petriho misku otevřeme a necháme odkrytou různě dlouhou dobu (např. 1 minutu nebo 10 minut)
• na agarovou půdu kýchneme
• na agarovou půdu otiskneme nějaký běžný předmět, minci, prsty, kapesník
• na agarovou půdu rozetřeme pár kapek vody (vodovodní, rybniční, z akvária)
• na agarovou půdu rozetřeme pár kapek kyselého mléka nebo jiných mléčných výrobků, zoctovatělého piva nebo vína
• na agarovou půdu rozetřeme malé množství kvasnic
• na agarovou půdu rozetřeme malé množství plísní (ze sýrů typu hermelín nebo niva, z kompotů nebo jiných potravin)

Kontaminované agarové půdy na spodním víčku Petriho misky necháme při pokojové teplotě na tmavém místě a prohlédneme po několika dnech - nejlépe po jednom až dvou týdnech. Vhodné je, pokud mají žáci k agarovým půdám volný přístup a mohou kontrolovat postupný nárůst mikroorganismů (třeba o přestávkách).

Hodnocení

Na agarových půdách si všímáme množství a rozmanitosti narostlých kolonií mikroorganismů. Namnožili jsme je do takového množství, že jsme schopni vidět je pouhým okem, a tím jsme prokázali jejich přítomnost v okolním prostředí. V Petriho misce, která byla nechána bez kontaminace, by neměly být žádné kolonie. Takto získaný biologický materiál můžeme dále makroskopicky (pouhým okem) i mikroskopicky hodnotit, popřípadě ho dále pěstovat po přeočkování na novou agarovou půdu.

Makroskopické hodnocení

Každý žák si vybere jakékoli 3 kolonie ze své Petriho misky a zjistí u nich velikost v mm, barvu, tvar, typ povrchu, typ okraje. Výsledky zaznamenává do tabulky.

Tabulka 1
Makroskopické hodnocení kolonií mikroorganismů (údaje se týkají celé kolonie)

Mikroskopické hodnocení

Vzorky kolonií, které žáci makroskopicky hodnotili, pozorují mikroskopem v kapce vody. Všímají si pohyblivosti (ano/ne) a tvaru buňky (koule, tyčinka, popřípadě spirála). Výsledky zaznamenávají do tabulky 2.

Tabulka 2
Mikroskopické hodnocení buněk přítomných v jednotlivých koloniích
(údaje se týkají jedné buňky, která je součástí dané kolonie)

Přeočkování na novou Petriho misku

Vzorek vybrané kolonie naočkujeme na čerstvý agar, a vypěstujeme tak čistou kulturu, která obsahuje pouze jeden druh bakterií. Tuto kulturu můžeme použít k práci v příštím laboratorním cvičení a pozorovat ji např. po obarvení.

Postup přeočkování

Sterilně odebereme kousek kolonie mikrobiologickou kličkou (předtím vyžíhanou v plameni kahanu a ochlazenou) nebo sterilním vatovým tampónem a na povrch nové agarové půdy zlehka nakreslíme klikatou čáru. Do agaru neryjeme. Petriho misku ihned zakryjeme víčkem, obrácenou dnem vzhůru a řádně označenou permanentním fixem necháme při pokojové teplotě několik dnů.

Janderová, J. - Zikánová, B.: Náměty pro laboratorní cvičení z biologie (1) - mikrobiologie (1. část). Biologie - chemie - zeměpis. 2000, ročník 9, č. 2, s. 66 - 69.
Kaprálek, F.: Mikrobiologické praktikum. Praha: Karolinum, 1999, ISBN 80-7184-927-8.
Malachová, K.: Cvičení z obecné mikrobiologie. Ostrava, Ostravská univerzita, 1992, ISBN 80-7042-696-9.
Pavelková, J. - Zikánová, B.: Náměty praktických cvičení s využitím mikroorganismů (1). Biologie - chemie - zeměpis. 2003, ročník 12, č. 5, s. 226 - 229.
Pavelková, J. - Zikánová, B.: Náměty praktických cvičení s využitím mikroorganismů (2). Biologie - chemie - zeměpis. 2004, ročník 13, č. 3, s. 122 - 126.